1.細胞接種

　　細胞數(shù)量：通常細胞增殖實驗每孔加入約2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入5000～10000個細胞。具體數(shù)量需根據(jù)細胞的大小、細胞增殖速度等決定。

　　培養(yǎng)時間：一般建議貼壁生長24小時，讓細胞充分貼壁且生長狀態(tài)穩(wěn)定，便于后續(xù)實驗操作與結(jié)果分析。

　　接種混勻：接種時注意細胞懸液一定要混勻，避免細胞沉淀導致每孔中的細胞數(shù)量不等。可以每接種數(shù)孔即混勻一下，確保細胞分布均勻。

　　2.藥物處理

　　設(shè)置對照：需設(shè)置空白組和對照組，空白組不加細胞只加培養(yǎng)基，用于扣除本底OD值；對照組加入細胞和培養(yǎng)基但不添加藥物，用于對比藥物處理組的細胞存活情況。

　　藥物濃度與體積：根據(jù)實驗?zāi)康暮图毎匦?，配制不同濃度的藥物溶液，并按一定體積加入到相應(yīng)的細胞孔中，如每孔加入10μL不同濃度的藥物刺激液。

　　3.孵育條件

　　溫度：一般哺乳動物細胞建議在37°C下進行孵育，其他種屬的細胞可根據(jù)其特定的細胞培養(yǎng)條件選擇合適的溫度。

　　氣體環(huán)境：需在含5% CO?空氣及濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育，以維持細胞的正常生長環(huán)境。

　　孵育時間：根據(jù)不同實驗細胞需求選擇適當?shù)姆跤龡l件和時間。例如，加藥后的孵育時間可設(shè)置時間梯度，通過觀察數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（一般在1.0左右）等來選擇孵育時間。

　　4.CCK8試劑添加

　　添加時機：在藥物孵育結(jié)束后，向每孔中加入適量的CCK-8溶液，一般為10μL。注意不要在一開始就加入CCK-8，否則會影響藥物的作用效果和檢測結(jié)果的準確性。

　　試劑用量：按照說明書的體系加入合適的CCK-8含量。如果細胞體系較大，可適當增加CCK-8的量，但要注意避免試劑過量或不足影響檢測結(jié)果。

　　5.CCK8細胞增殖毒性檢測試劑盒吸光度測定

　　測定波長：使用酶標儀在450nm處測定吸光度，此波長是CCK-8試劑檢測的適宜波長。

　　測定時間：在加入CCK-8試劑后，需再次孵育一段時間再進行吸光度測定。對于不同的細胞類型，孵育時間有所不同，如白細胞較難顯色，可能需要較長的CCK-8反應(yīng)時間或增加細胞數(shù)量；懸浮細胞與貼壁細胞相比也較難顯色，孵育時間一般為1-4小時，多數(shù)細胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng)，培養(yǎng)3.5-4小時左右檢測效果佳。

　　6.結(jié)果計算與分析

　　細胞存活率計算：細胞存活率=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%，通過該公式計算出各組細胞的存活率，從而評估藥物對細胞的增殖或毒性影響。

　　數(shù)據(jù)分析：盡量多設(shè)置復孔，取平均值以減少誤差。同時，可通過繪制細胞存活率曲線等方式直觀地展示藥物濃度與細胞存活率之間的關(guān)系。